SAXS pour la caractérisation de produits biologiques

La méthodologie SAXS disponible chez DANNALAB suit les concepts génériques développés par des entreprises spécialisées, telles que le Laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL). La plupart des informations utiles identifiées par la SAXS sont liées à la structure d’ordre supérieur de la macromolécule, à l’état oligomère, à la voie d’agrégation et aux espaces conformationnels des systèmes flexibles. Cette méthode a pour avantage de permettre l’observation d’objets colorés ou fixés, les présentant dans leurs environnements aqueux natifs (à la différence de la cristallographie par rayon X, qui nécessite généralement que l’échantillon soit placé dans un environnement non physiologique).


Reconstruction des structures d’ordre supérieur des produits biologiques

La structure atomique des biopolymères à l’état cristallin est traditionnellement déterminée à l’aide de la diffraction au rayon X monocristal. Bien qu’il s’agisse d’une approche puissante et établie, l’étape de cristallisation constitue un inconvénient. Cela devient une tâche difficile pour les molécules importantes sur le plan pharmaceutique, telles que les protéines membranaires.

Les propriétés structurelles d’un biopolymère dans un environnement biologique naturel, tel que sa structure d’ordre supérieure, peuvent être examinées à l’aide de la SAXS et font souvent l’objet d’un intérêt indépendant. Cela est dû au fait que la structure réelle du biopolymère en solution peut varier de sa structure cristalline en raison de sa flexibilité conformationnelle et de la tendance à former des oligomères ou agrégats.


La SAXS est considérée comme étant l’outil de choix pour déterminer la structure tertiaire et quaternaire des biopolymères dans des environnements aqueux proche d’un environnement naturel. Avec la solution basée sur la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la cryo-microscopie, la SAXS est la seule méthode capable de visualiser les structures d’ordre supérieur réelles du biopolymère dans son environnement natif.

Il est possible de reconstruire (ab initio ou à partir d’un modèle) la structure de l’enveloppe de faible résolution à l’aide de la SAXS avec une formulation à 0,25 %m du biopolymère dans la solution tampon appropriée – comme l’illustre l’exemple ci-dessous :



Exemple 1 : Gauche – Structure de l’enveloppe de l’immunoglobuline IgG1, reconstruite expérimentalement par diffusion en solution – 0.25%m en solution tampon (DANNALAB B.V. 2011) Droite – Structure cristallographique haute résolution enregistrée comme entrée 1IGY dans la base de données des protéines (Protein Data Bank – www.pdb.org)


Investigation des peptides et systèmes flexibles

Pour les peptides ayant une structure 3D définie en diffusion, la méthode de reconstruction ab-initio peut être utile pour accéder aux dimensions, à l’état oligomère et à la masse moléculaire approximative – comme l’illustre l’exemple ci-dessous :


Exemple 2. Gauche – structure haute résolution du noyau de HIV GP41 (enregistré 1AIK dans la base de données des protéines) comparée à la structure reconstruite par SAXS de l’inhibiteur trimère de fusion HIV dans une solution tampon de phosphate (5 mg/ml à heure 0) montré à droite. (Publié avec la permission de l’équipe de projet IWT du département Recherche & Développement de la compagnie pharmaceutique Johnson&Johnson, d’autres exemples sont disponibles en cliquant sur ce lien - (TIDES 2012)).

Avec la structure de l’enveloppe, les invariants structuraux utiles, comme le rayon de giration et le volume exclu, sont aussi déterminés.

Pour les systèmes flexibles, tels que les protéines naturellement dépliées, nous utilisons une approche différente (qui suit la méthode de Bernado et co-auteurs, 2007) au cours de laquelle, comme dans le cas de la solution RMN, le système est présenté comme un ensemble des conformations les plus probables qui correspondraient le mieux à l’expérience, tel que l’illustre l’exemple ci-dessous :


Exemple 3. L’alpha-synucléine est une protéine naturellement dépliée avec deux domaines (1-60, 61-95) connectés par un lien flexible et un troisième domaine (96-140). Dans cette expérience, les conformations co-existantes d’alpha-synucléine en présence de différentes concentrations de SDS (simulant la liaison à la membrane) ont été examinées par SAXS. Par conséquent, l’ensemble des conformations sélectionnées (sur plusieurs milliers possible) est présenté comme étant représentatif des données de diffusion observées. Les conformations identifiées ont été groupées pour sélectionner quelques groupes ou « types » co-existants. Les membres d’un de ces groupes sont présentés ci-dessus après alignement rotatif 3D. L’apparition de ces groupes « en U » dans l’ensemble total des conformations précèderait la toxicité alpha-synucléine. (DANNALAB B.V. 2011, Projet NanoNextNL) ;

La SAXS dans le cadre des études de stabilité

Les produits pharmaceutiques biologiques sont connus pour être particulièrement sensibles aux facteurs environnementaux comme les variations de température, l’oxydation, l’exposition à la lumière et autres stress. Un contrôle régulier des propriétés physico-chimiques de la substance pharmaceutique finale ou en cours d’élaboration est nécessaire pour répondre aux exigences en matière de durée de conservation.

Les informations sur les paramètres structurels obtenues à l’aide des mesures SAXS, comme la forme de l’enveloppe et les invariants (masse et rayon de giration), sont des marqueurs importants qui sont liés à l’activité biologique. Si des changements sont observés avec le temps, cela indique une dégradation potentielle du produit biologique.


Des informations complémentaires et des exemples de tests sont disponibles ici.