SAXS zur Charakterisierung von Biopharmazeutika

Die SAXS Methodik bei DANNALAB folgt den allgemeinen Konzepten, die an Beamlines entwickelt wurden, insbesondere an der EMBL-Beamline. Der größte Teil der Informationen, der durch SAXS-Messungen erhalten werden kann, bezieht sich auf die höher geordnete Struktur von Makromolekülen, den oligomeren Zustand, Aggregationsweg und Konformationszustand flexibler Systeme. Ein Vorteil des Verfahrens ist, dass es die Analyse von Objekten erlaubt, die nicht behandelt oder fixiert wurden und die sich in ihrer nativen wässrigen Umgebung befinden (im Gegensatz zu Röntgenkristallographie, die im allgemeinen Proben in einer nicht-physiologischen Umgebung erfordert).


Die Rekonstruktion der höheren Ordnungsstruktur von Proteinen

Die atomare Struktur von Biopolymeren im kristallinen Zustand wird traditionell mit Röntgen-Einkristallanalyse bestimmt. Zwar ist dies ein leistungsfähiger und etablierter Ansatz, der Nachteil ist jedoch die Notwendigkeit der Kristallisation. Dies kann eine sehr anspruchsvolle Aufgabe für einige pharmazeutisch wichtige Moleküle wie beispielsweise in dem Fall von Membranproteinen sein.

Die strukturellen Eigenschaften eines Biopolymers in einer biologischen Umgebung wie z.B. seine höher geordnete Struktur können durch SAXS untersucht werden und sind häufig von unabhängigem Interesse. Der Grund dafür ist die Tatsache, dass sich die tatsächliche Struktur eines Biopolymers in Lösung von der Kristallstruktur aufgrund der Konformationsflexibilität und der Neigung Oligomere oder Aggregate zu formen, unterscheidet.


SAXS wird als das Werkzeug der Wahl angesehen, wenn die tertiäre und quartäre Struktur eines Biopolymers in einer nahezu natürlichen wässrigen Umgebung zu bestimmen ist. Zusammen mit Lösungs-NMR und Kryo-Mikroskopie sind dies die einzigen verfügbaren Methoden, um die tatsächliche Struktur höherer Ordnung eines Biopolymers in der natürlichen Umgebung zu visualisieren.

Die ab-initio oder modellbasierte Rekonstruktion einer niedrig aufgelösten äußeren Struktur der Biopolymer-Hülle durch Röntgen-Kleinwinkelstreuung kann mit nur 0,25 wt% Formulierung des Biopolymers in dem geeigneten Puffer möglich sein - wie im unteren Beispiel dargestellt:



Beispiel 1: Links – äußere Proteinhüllenstruktur von Immunglobulin IgG1, aus Streuexperimenten an der Lösung rekonstruiert - 0,25% wt in einem Puffer (DANNALAB BV ® 2011). Rechts - hochauflösende Kristallstruktur als 1IGY Eintrag in der Proteindatenbank hinterlegt www.pdb.org)


Untersuchung von Peptiden und flexiblen Systemen

Für Peptide mit einer definierten 3D-Struktur in Dispersion können die Verfahren der ab-initio Rekonstruktion nützlich sein, um die Abmessungen, den oligomeren Zustand und die ungefähre Molekülmasse zu bestimmen - wie in Beispiel 2:


Beispiel 2: Links - hochauflösende HIV GP41 Kernstruktur (1AIK Eintrag in Proteindatenbank); im Vergleich zur rechts gezeigten, mittels SAXS rekonstruierten Struktur des trimeren HIV-Fusions-Inhibitors im Phosphatpuffer (5 mg / ml bei 0 Stunden). (Veröffentlicht mit Genehmigung des IWT Projektteams von Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, weitere Beispiele finden Sie unter diesem link - (TIDES 2012)).

Zusammen mit der Hüllen-Struktur werden ebenfalls nützliche Struktur-Invarianten wie Gyrationsradius und Verdrängungsvolumen bestimmt.


Für ein flexibles System wie zum Beispiel bei natürlich ungefaltet vorliegenden Proteinen verwenden wir einen alternativen Ansatz an (nach Bernado und Co-Autoren, 2007), wo ähnlich wie bei der Lösungs-NMR das eigentliche System als Ensemble der wahrscheinlichsten Konformationen - die durch das Kriterium der besten Übereinstimmung mit dem Experiment bestimmt wurden - präsentiert wird. Wie im folgenden Beispiel:


Beispiel 3: Alpha-Synuclein ist im natürlich Zustand ein ungefaltetes Protein mit zwei Teilbereichen (Domänen) (1-60, 61-95), die durch einen flexiblen Link und eine dritte flexible Domäne (96-140) verbunden sind. In dem Experiment wurde die Koexistenz der Konformere von alpha-Synuclein für verschiedene Konzentrationen von SDS (simulierte Bindung zur Membran) mit SAXS untersucht. Als Ergebnis wurde ein ausgewählter Satz von Konformeren (aus einer Menge von Tausenden) als repräsentativ für die beobachteten Streudaten gefunden. Die identifizierten Konformere wurden gruppiert, um einige verschiedene koexistierende Cluster oder "Typen" auszuwählen. Die Mitglieder eines der Cluster sind oben nach 3D-Ausrichtung dargestellt. Das Aufkommen dieses "U-Form" Clusters innerhalb des gesamten Ensembles von Konformeren steht im Verdacht, ein Vorläufer für Alpha-Synuclein Neurotoxizität zu sein (DANNALAB BV ® 2011 NanoNextNL Projekt).

SAXS in Stabilitätsstudien

Biopharmazeutika sind dafür bekannt, dass sie besonders empfindlich gegenüber Umwelteinflüssen wie z.B. Temperaturwechsel, Oxidation, Licht und Scherkräften sind. Eine regelmäßige Überwachung der physikalisch-chemischen Eigenschaften eines Zwischenprodukts oder einer Fertigarzneimittelsubstanz sind erforderlich, um nachzuweisen, dass sie den Haltbarkeitsspezifikationen entspricht.


Informationen über Strukturparameter, die aus den SAXS Messungen erhalten wurden, wie beispielsweise die räumliche Gestalt der Proteinhülle und Invariante Parameter (Masse und Gyrationsradius), dienen als wichtige Marker, die mit der biologischen Aktivität korreliert werden können. Wenn zeitliche Veränderungen identifiziert werden können, sind diese ein Hinweis auf einen möglichen Abbau des Biopharmazeutikas.


Weitere Informationen und Beispiele stehen hier zur Verfügung.